本文首发于公众号「呼气试验」，此处为归档版本。

呼气分析是一种快速、非侵入性手段，用于检测作为疾病标志物的挥发性有机化合物。糖尿病患者因代谢脂肪而非葡萄糖产生能量，导致体内酮体（如乙酰乙酸、β-羟基丁酸和丙酮）过量，其中丙酮可通过呼吸排出。多种技术，包括气相色谱质谱法（GC-MS）、质子转移反应质谱法（PTR-MS）、选择离子流管质谱法（SIFT-MS）及激光光声光谱法，可用于分析呼出气体。

01

引言

无创技术，尤其是纳米呼吸传感器技术，具有便携、廉价、高灵敏度和易于使用等特点，在糖尿病监测方面具有潜力。根据国际糖尿病联合会（IDF）的数据，到 2030 年，糖尿病将成为第七大死因，到 2030 年，全球糖尿病患者人数将比 2011 年显著增加 50%以上。因此，人们迫切需要一种更好的、无痛的方法来监测 1 型和 2 型糖尿病。管理和监测血糖可降低糖尿病昏迷的风险，并最终降低死亡率。呼吸丙酮已被证明与血糖水平密切相关。

人体呼出的气体中含有数千种不同的挥发性有机化合物 (VOC)，它们来自人体的新陈代谢过程。糖尿病患者体内会产生过量的酮体（如丙酮），这是因为人体使用脂肪而不是葡萄糖来产生能量，然后在呼吸过程中将这些酮体呼出。丙酮已被成功用作糖尿病的生物标志物，尤其是 1 型糖尿病患者。在空腹、运动或糖尿病期间，肝脏会产生酮体作为额外的能量来源，随后代谢为丙酮和其他酮体。产生的丙酮通过血液循环，通过尿液或呼出的气体排出体外。研究发现，呼出的气体在血液中的分配系数为 330：1。研究发现，利用呼气分析技术对人体呼气中的丙酮浓度进行定量分析，与血液中的丙酮浓度和其他酮体（如 beta-羟基丁酸）的浓度密切相关。因此，测量呼气中的丙酮能更好地诊断控制患者的糖尿病状况，而不是仅仅测量血糖。     

02

丙酮代谢

丙酮是一种呼出的挥发性有机化合物，已被用作糖尿病（尤其是 1 型糖尿病）的生物标志物。如图 1 所示，丙酮来源于非酵解脂肪酸的氧化，通过自发脱羧或酶转化产生乙酰-CoA，最终产生乙酰乙酸。产生的丙酮通过血液，并通过尿液、汗液和/或呼出的气体排出体外。对于呼出的气体，研究发现其在血液中的分配系数为 330：1。研究发现，利用呼气分析技术对人体呼气中的丙酮浓度进行定量分析，结果与血液中的丙酮浓度和其他酮体（如 beta-羟基丁酸）的浓度密切相关。此外，Worrall 等人的另一项研究发现，血糖与挥发性有机化合物之间存在相关性。因此，测量呼出气体中的丙酮比单纯测量血糖能更好地诊断控制患者的糖尿病状况。    

图 1. 酮代谢

呼气中的丙酮水平也被用于检测和监测糖尿病患者血液中β-羟基丁酸水平的异常浓度。据报道，皮肤也会释放出丙酮，其浓度与呼出丙酮和血液中的β-羟基丁酸相关。糖尿病患者的丙酮气味被用作糖尿病酮症酸中毒的症状，因为丙酮是乙酰乙酸自发分解产生的直接副产品。然而，轻度酸中毒可能是由于长期禁食或正在进行生酮饮食或极低热量饮食所致。医学研究人员发现，正常人呼出气体中的丙酮浓度低于百万分之 0.8，而七名糖尿病患者和七名非糖尿病患者呼出气体中的丙酮浓度高于百万分之 1.8。不过，安德森的研究表明，在不同的情况下，呼出气体中丙酮的含量范围也不同。例如，服用生酮饮食的成人体内丙酮含量可高达 40 ppm。患有癫痫的儿童接受生酮饮食治疗以减少癫痫发作，这导致呼气丙酮浓度高达 360 ppm。这是因为禁食会导致人体主要利用脂肪来产生能量。这些过程会导致呼气丙酮浓度达到 170 ppm。糖尿病控制不佳会导致酮症酸中毒，从而使呼气丙酮浓度升高至 1250 ppm。

03

用于糖尿病监测和诊断的各种技术    

监测呼气中的多种挥发性化合物是一个前景广阔且不断扩展的领域。气相色谱-质谱联用（GC-MS）、固相微萃取（SPME）、高效液相色谱（HPLC）、选择离子流管质谱（SIFT-MS）和液相色谱-质谱（LC-MS）等技术可对呼气中的挥发性有机化合物进行高选择性分析。虽然气相色谱和其他上述分析方法对糖尿病的诊断具有高灵敏度和高选择性，但它们价格昂贵，而且考虑到糖尿病应在日常医疗保健中实时监测和诊断，因此便携性问题尤为重要。

气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）

气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）是一种将气相色谱的分离能力与质谱的检测能力相结合的联用技术。它在确定混合物中存在多少成分及其各自比例方面发挥着重要作用。质谱检测器通常用于获取分子的 “指纹 ”光谱。质谱可提供分子量、元素组成、存在的官能团等信息，在某些情况下，还可提供分子的几何形状和空间异构性等信息。

使用气相色谱-质谱仪分析呼出气体中的丙酮需要进行样品制备，包括丙酮标准制备和丙酮在固相微萃取（SPME）针上的衍生化。由于丙酮的质量太小，而且丙酮易挥发，因此大多采用 SPME 衍生法。丙酮标准品的制备大约需要 20 分钟，而在 SPME 上进行衍生需要 20 分钟。样品制备的另一个缺点是收集病人的呼气，这需要昂贵的 Tedlar 袋。Tedlar 袋只能储存人体呼气不超过 6 小时。在毛细管柱上完全分离气体混合物的成分需要相当长的时间，至少几分钟甚至几十分钟。

质子转移反应质谱法（PTR-MS）

质子转移反应质谱法（PTR-MS）是一种专门用于检测空气中气态有机化合物的技术。在 PTR-MS 系统中，初级离子 H3O+ 与中性离子在规定条件下发生反应。与气相色谱-质谱（GC-MS）相比，PTR-MS 不需要对样品进行预浓缩，就能以高灵敏度（低至万亿分之一）提供挥发性有机化合物的相对浓度。此外，PTR-MS 还可以进行在线测量（例如整夜测量）。另一方面，PTR-MS 的缺点包括无法区分分子量相同的物质。因此，通过特定质量电荷比（m/z）的产物离子确定的所有物质都必须被视为可能的成分。    

选择离子流管质谱法（SIFT-MS）

选择离子流管质谱法（SIFT-MS）也是同时对空气和呼气中多种痕量气体进行实时定量的分析技术之一。它依赖于使用 H3O+、NO+ 和 O2 + 前体离子对空气/呼气样品中的痕量气体分子进行化学电离。前体离子和痕量气体分子之间的反应会在精确规定的时间内进行，前体离子和产物离子由下游的质谱仪检测和计数，从而实现量化。SIFT-MS 可测定单次呼气中痕量气体的绝对浓度，最低可达 ppb 级，无需收集样品和校准。作为一种潜在的糖尿病监测仪器，SIFT-MS 的不足之处在于无法识别混合气体中的化合物。

量子级联激光器（QCL）

量子级联激光器（QCL）是一种利用导带内跃迁的半导体激光器。因此，波长可以通过激光层的厚度来定制，而不是由带隙来决定。这些激光器可以在从 ~3 µm 到 ~24 µm 的各种波长范围内工作。它们是非常有前途的气体传感应用光源。基于宽调谐 QCL 的系统可用于测量多种气体，而窄目标系统则可检测和测量万亿分之一范围内的气体浓度。激光光谱学的原理基于激光在与特定气体的光谱吸收线相对应的频率上被吸收。这些吸收线来自分子的电子态、旋转态或振动态。电子态跃迁与其他两种跃迁相比能量更高，因此可以使用可见光或近紫外波长进行检测。旋转态和振动态的跃迁能量要低得多，因此可以使用近红外和中红外光源进行探测。然而，发生在中红外区域的跃迁要强得多，因此探测极限要低得多。基于 QCL 的系统正被应用于不断发展的医疗诊断领域。这种应用需要极快的采样时间、相对较小的尺寸和准确的结果，以避免误诊；QCL 可以满足这些标准。然而，QCL 在诊断和监测糖尿病方面还存在一些局限性，包括实际应用所需的选择性，以及目前受现有技术限制无法达到足够高的规格。    

光寻址电位传感器（LPAS）

光寻址电位传感器（LPAS）是基于辐射效应的生化传感器的一部分。它们能够以空间分辨的方式监测传感器表面的分析物浓度。LAPS 原理由 Hafemann 等人于 1988 年提出，基于扫描光脉冲技术（SLPT）（engestrom），旨在测量水溶液中的浓度。LAPS 的最大优势在于其光可寻址性，这使得高集成度水平很容易获得。与传感器阵列相比，LAPS 可以获得更多的信息。其较大的连续表面可用于确定气体的方向，作为气体识别的附加信息。基于 LAPS 的呼吸气体图像检测被提出作为糖尿病诊断的一项发展。

表 1. 呼出丙酮分析技术的比较

技术

原理

检测限

优点

缺点

GC–MS

使用色谱柱 (极性或非极性) 通过MS分离和分析化合物

Ppb and ppt levels

高度选择性和敏感性

预浓缩步骤，笨重，采样时间长，需要标准，需要训练有素的操作员

PTR–MS

通过与H3O MS反应分析目标分析物的电离分子        

Low ppb levels

实时分析

缺乏规格性，可检测的化合物范围窄，体积庞大，需要训练有素的操作人员

SIFT–MS

通过四极质谱分析反应分析物和前体物（H3O+、NO+ 或 O2+）产生的离子

Low ppb and ppt levels

实时，可检测 ppt，检测范围广

无法识别化合物，体积庞大，需要训练有素的操作员

QCL

电子从一个周期循环到另一个周期，每次都包含增益和光子发射。

Low ppb levels

实时分析、便携性和微型化潜力

实际应用所需的选择性，目前受到现有技术的限制，无法达到足够的规格

LPAS

痕量气体分析。它利用了光声效应，即光在所有材料（固体、液体和气体）中转化为声音的过程。

Ppt–ppb levels

实时分析

笨重，需要训练有素的操作员

SMOS-based chemoresistive sensors        

在暴露于氧化或还原性环境气体时，根据表面周围 n 型 SMOS 耗尽层和 p 型 SMOS 的空穴积聚层变薄或变厚的情况，测量电阻率的变化

Ppm, ppb and ppt levels

实时分析、便携、廉价和微型化

灵敏度相对较低，选择性较差

目前已开发出几种利用质谱分析呼出丙酮样品的在线检测方法，如质子转移反应质谱法（PTR-MS）、选择离子流管质谱法（SIFT-MS）和气相色谱-离子迁移谱法（GC-IMS）。在已开发的挥发性有机化合物分析方法中，气相色谱-质谱法（GC-MS）是最有前途的技术之一。由于典型挥发性有机化合物的高灵敏度，气相色谱-质谱法已被广泛用于呼气分析。然而，典型呼气样本中的挥发性有机化合物浓度很低，因此在大多数情况下，要想灵敏准确地测定挥发性有机化合物，仍需在分析前对样本进行预浓缩处理，如冷阱法或吸附阱法。这些方法灵敏度高，但往往需要耗费大量时间。SPME是气相色谱分析中最先进的采样技术之一，与传统的萃取方法相比具有操作简单、无溶剂和易于自动化等优点。表2列出了利用各种分析技术从糖尿病患者身上提取的丙酮呼气浓度。

表 2. 不同检测技术中呼出丙酮浓度    

04

基于纳米材料的丙酮检测方法

近年来，纳米技术在化学电阻传感器呼吸分析领域的应用日益增多。这些构件的纳米级尺寸使其具有多种特性，例如大的表面体积比以及独特的化学、光学和电学特性。纳米材料的大表面积提供了高活性界面，从而提高了灵敏度，缩短了响应和恢复时间。不同的纳米材料已被用于挥发性有机化合物传感元件，包括不同材料的纳米颗粒和纳米线。此外，基于纳米材料的气体传感器的动态范围和选择性都可以进行定制，以准确检测特定疾病的特定呼气挥发性有机化合物。

基于半导体金属氧化物的化学电阻传感器因其微型化的潜力、低成本、制造简单、易于使用、与微电子工艺的良好兼容性和可靠性而备受关注。过去几年中，化学电阻传感器主要用于检测人体呼气中的亚ppm 丙酮。研究发现，纳米级伽马二氧化铁（γ-Fe2O3）传感器能够在正常呼气中存在的挥发性有机化合物背景中检测出 1 ppm 的丙酮。丝网印刷二氧化钛（TiO2）传感器显示出对 1 型糖尿病诊断的灵敏度。此外，原始和铂功能化的三氧化钨（pt-WO3）半缩管对 H2S 和丙酮气体具有极高的灵敏度和响应。WO3，尤其是其 ε 相，有望在 ppb 浓度范围内对丙酮进行选择性定量检测。这要归功于ε相的自发电偶极矩，它增加了与具有高偶极矩的分析物（如丙酮）的相互作用。目前，化学阻抗SMO在用于便携式实时糖尿病诊断的呼气传感方面受到了广泛关注。    

使用 SMOs 的理由是它们具有多种优势，既可以是复合材料（如 ZnO:Pt、ZnO:Nb、In/WO3-SnO2 或二维 C3N4-SnO2），也可以是掺杂（如用金和钯装饰的 WO3），还可以是纯金属氧化物（如 TiO2、二维 ZnO 纳米片或 In2O3 纳米颗粒）。这些优势包括成本低和易于制造。有关用于丙酮传感的金属氧化物的大多数报告都强调了 SMOs 的简易合成。

固态传感器基于薄膜材料表面的吸附/解吸或化学反应。这将导致物理结构发生变化，而传感器装置可检测到物理结构的变化。物理结构包括温度、折射率、质量等的变化。考虑到影响金属氧化物气体传感特性的因素，有必要揭示金属氧化物气体传感器的传感机理。导致气体传感器响应的确切基本机制仍存在争议，但从本质上讲，吸附分子上的电子捕获和这些带电分子引起的带弯曲是导致电导率变化的原因。这些氧气中的负电荷会导致带弯曲向上，从而使电导率低于带宽情况。当氧气分子吸附在金属氧化物表面时，它们会从导带中提取电子，并以离子的形式将电子俘获在表面。这将导致带弯曲和电子耗尽区。这些氧物种与还原气体的反应或竞争性吸附以及其他分子对吸附氧的置换会减少并逆转带弯曲，从而导致电导率增加。在大多数金属氧化物气体传感器的工作温度 300-450 ◦C 时，O- 被认为是主要的氧。

影响金属氧化物灵敏度的因素多种多样。这些因素包括化学成分、贵金属颗粒的表面改性、微观结构、湿度和温度。除化学成分外，基于两种混合成分的传感器往往比单独成分的灵敏度更高。Kim 等人在 2016 年发现了一种使用 Rh2O3 功能化的 WO3 纳米纤维的灵敏且具有选择性的丙酮传感器。此外，电导率响应还受气体传感材料表面与检测气体参与催化反应的效率影响。因此，控制气体传感器材料的催化活性是提高气体传感器性能的最常用手段之一。然而，在实际应用中，广泛使用的气体传感金属氧化物材料，如 TiO2、ZnO、SnO2、Cu2O、Ga2O3 和 Fe2O3 等，从催化的角度来看活性最低。不含任何催化剂的纯二氧化锡薄膜的灵敏度非常低（约为 3），这也证实了上述说法。此外，当我们继续研究影响传感器灵敏度的因素时，微观结构起着至关重要的作用。例如，使用晶粒尺寸非常小的材料可以显著提高传感器的灵敏度，这一模拟结果与实验观察结果非常吻合。Lu 等人指出，如果颗粒直径小于 10 纳米，基于二氧化硫的传感器对 500 ppm CO 的响应就会急剧增加。    

05

半导体金属氧化物的局限性

半导体金属氧化物的主要局限性一般包括以下几个方面：

灵敏度

每个分析物单位的测量信号变化，即校准图的斜率

选择性

决定传感器是否能对单一分析物做出选择性反应的特性

稳定性

传感器在一定时间内提供可重复结果的能力。这包括保持灵敏度、选择性、响应和恢复时间

耐久性

即承受因温度、化学添加物等造成的损坏的能力

响应时间

即传感器对从零到一定浓度值的阶跃浓度变化做出反应所需的时间

恢复时间        

传感器信号从某一浓度值阶跃变为零后恢复到初始值所需的时间

室温操作

即在室温下检测气体的能力

研究发现，控制材料的粒度和孔隙率可以提高材料的灵敏度。当平均粒度减小到几纳米时，SMO具有很高的灵敏度。利用表面活性剂自组装并经磷酸处理而制成的二氧化锡和二氧化钛介孔粉末，以及表面经介孔二氧化锡修饰的传统氧化锡粉末，都比相应的金属氧化物粉末材料具有更高的传感器性能，因为后者的比表面积较小。掺杂也是提高使用已久的SMO传感器灵敏度的一种方法。通过在氧化物表面分散低浓度的添加剂，可以大大提高金属氧化物气体传感器的灵敏度。

解决选择性问题的方法有两种。第一种方法是制备一种材料，这种材料对一种分析物严格敏感，而对工作系统中存在的其他分析物的交叉敏感性较低或为零。为此，首先要优化工作温度、掺杂元素及其浓度。第二种方法是制备用于区分混合物中几种分析物的材料。使用一个传感器信号是不可能做到这一点的；因此，通常通过调节传感器温度或使用传感器阵列来实现。

稳定性低会导致误报、结果不确定以及需要更换传感器等问题。具有小颗粒、纳米棒、纳米管、纳米线等的金属氧化物由于反应活性高，很容易降解。不过，通过煅烧和退火等后处理方法以及降低传感器元件的工作温度，可以提高稳定性。

寻求对糖尿病进行无创诊断和监测仍然是全世界的目标。目前正在开发其他辅助技术，以帮助医疗保健部门对糖尿病进行无创监测。其中包括葡萄糖传感技术，这种技术对葡萄糖具有选择性，对葡萄糖浓度的变化具有快速、可预测的反应。继无创血糖传感技术之后，该技术无需采集血液样本即可测量体内血糖浓度。它使用近红外光谱来完成这种测量。其原理是将一段近红外辐射穿过人体的血管区域，然后从产生的光谱信息中提取相应的血糖浓度。目前有不同的护理点检测（POCT）设备，它们基于电化学或光学检测来测量血糖。    

06

结论

对糖尿病诊断和监测新技术的探索一直在不懈地进行。目前，已有成熟的丙酮检测分析方法，包括 GC-MS、SIFT-MS、PTR-MS 等，并已应用于研究和临床。迄今为止，血糖和血酮与呼气丙酮相关性的临床示范已取得成功。人体呼气分析是一种非常有前途的疾病检测方法，因为它无创伤且诊断方法简单，特别是对于需要每天监测血糖的糖尿病患者。因此，监测呼气丙酮将成为糖尿病检测的低成本、无创的创新技术。