本文首发于公众号「呼气试验」，此处为归档版本。

现代呼吸测试的时代始于1971年，诺贝尔奖得主莱纳斯-鲍林的工作。从那时起，已有数百篇科学论文发表，表明在一系列疾病中存在VOC生物标志物（如下图所示）。然而，在这些已发表的研究中，在一种疾病中确定的生物标志物的一致性有限。

采样和分析方面的挑战阻碍了对呼吸中强大的VOC生物标志物的鉴定。此外，试点研究中病人数量少，以及缺乏盲法验证研究，阻碍了VOC生物标志物进入临床。

通过努力理解并克服呼吸分析的挑战，Owlstone Medical建立了强大的工作流程来分析呼吸中的VOCs，以便在临床管道和呼吸活检服务中进行呼吸生物标志物研究。

Owlstone Medical的呼吸活检平台将呼吸作为一种新的诊断方式。现在，第一次有可能利用呼吸进行强大的生物标记物发现。

1、在呼吸取样和分析方面取得进展

历史上，对呼吸中的VOCs进行强有力的、可重复的分析带来了许多技术和分析上的挑战，导致不同研究之间的一致性有限。

下表概述了呼吸研究人员所面临的历史性挑战，以及目前通过呼吸采样和分析的技术进步所获得的解决方案。

呼吸采样和VOC分析的挑战和解决方案

历史挑战

解决方案

呼吸采样

l缺乏标准化的呼吸收集装置 

l收集的呼吸量不同 

l环境中的外源性VOCs污染 

Tedlar®和其他聚合物储存袋：

l由于收集的是单一的呼气，所以灵敏度有限 

l袋子中的VOCs损失很大 

l袋子内表面的水凝结会吸附VOCs 

l外部VOCs通过袋子进入 

l袋子中的VOCs污染 

l重新使用袋子时VOCs的结转

ReCIVA呼吸采样器： 

l可靠的、可重复的呼吸采集 

l采集确定的呼吸量 

l在大约10分钟内连续采集VOC，以提高灵敏度 

l将呼吸样品采集到呼吸活检盒上 

l呼吸活检盒中的疏水吸附剂将水的干扰降至最低

lCASPER®便携式空气供应器将外部VOC污染降至最低

呼吸分析

高端分析仪器，如质谱：

l昂贵而笨重 

l仪器间的差异 

l需要专门知识来正确操作 

l产量有限 

“电子鼻”（eNose）：

l时间稳定性有限 

l化学选择性差

微芯片化学传感器（FAIMS）：

l比MS更容易操作 

l对复杂的生物样品中的目标VOC具有卓越的稳健性和可重复性 

l与eNose系统相比，稳定性、灵敏度和选择性得到提高 

l与MS相比，体积小

2、研究设计

与任何 “全息 “技术一样，识别呼吸中强大的VOC生物标志物通常包括三个阶段：

1.发现 

2.验证 

3.确认

上述阶段包括发现最佳分类器的研究，在更大的患者群中验证分类器，并在代表预期使用人群的更大的患者群中进行外部盲法验证，以验证VOC生物标志物算法和分析仪器，共同构成一个可供监管部门批准的诊断测试。 

了解预期的临床部署场景是富有成效的研究设计的关键组成部分。原则上，受试者的纳入和排除标准应尽可能与临床场景相匹配，以最大限度地提高所确定的生物标志物的外部有效性。然而，在设计旨在识别呼吸生物标志物的研究时，需要考虑到一些一般的概念。

成功的呼气生物标志物研究的提示 

  • 使用强大的、可重复的、标准化的呼气采样方案。 

  • 选择代表预期使用人群的患者队列。 

  • 在伴随研究的病例报告表（CRF）中记录潜在的混杂因素，并评估可能影响生物标志物信号的系统偏差或混杂因素。

2.1 分析前的变量和混杂因素

与呼气分析有关的挑战包括呼气取样方法的变化（如取样总呼气与肺泡呼气，或单次呼气与固定时间/容量）所带来的变化，呼气流量和屏气的影响，样品收集材料的类型，VOC回收，以及样品预处理。

至关重要的是，研究中的所有呼气样本都应使用强大的、可重复的、标准化的呼气采样方案来收集。

此外，许多因素有可能对呼出气体中的VOCs情况产生影响，包括环境吸入的挥发物、湿度的影响、食物/药物、运动、吸烟和合并症，如下图所示。

在试点或概念验证研究的情况下，一种方法是试图控制这些变量，以尽量减少它们对检测呼吸生物标志物能力的潜在影响。然而这可能不是最有用的方法，原因如下：

1）试点研究中获得的信号可能不会在随后的验证研究中得到证实，包括更大的患者群，其中潜在的变量可能没有得到很好的控制。

2）规定严格的条件以尽量减少变异，可能会对在临床实践中实施该试验带来挑战。

3）导致VOC轮廓的许多因素可能在病例和对照中随机分布，因此适当的统计技术可以防止它们对诊断性能产生巨大影响。

4）导致VOC轮廓的因素实际上可能构成信号的一部分，并提高生物标志物轮廓的临床相关性。

可以采取三种预防措施，尽量减少潜在变量对研究结果的影响，并最大限度地提高检测生物信号的能力。

1）受试者的选择标准应在实际可行的情况下尽量反映测试的实际人群。这意味着潜在的混杂因素不太可能影响生物标志物的发现。

2）潜在的混杂因素应被考虑并记录在研究附带的病例报告表（CRF）中。评估可能影响生物标志物信号的系统性偏倚或病例组和对照组之间分布不均的混杂因素至关重要。临床背景数据可用于评估呼吸生物标志物能识别某些混杂因素存在的准确性。

3）应通过减少背景噪音，并使用良好的标准化和验证的呼吸收集方法和分析管道，使信噪比最大化。

2.2 队列规模

文献中报道的许多呼吸分析研究涉及小规模的患者队列，这限制了研究结果的统计学意义，并使调查可能的混杂因素的影响成为挑战。

达到统计学意义所需的样本量既取决于样本间的差异，也取决于研究想要显示的差异的预期幅度。在一个包括不同人类个体的队列中，人口可能是相当异质的，具有高度的生物差异。

如果目标是识别队列中各亚组之间VOC水平的极小差异，那么可能需要大量的样本。功率分析可用于评估检测某一特定规模的效应所需的样本数量。

2.3 患者群体

应注意不仅要选择最佳的队列规模，而且要选择适当的病人群体。这个病人群体可能会根据研究阶段的不同而不同。

最初的发现或试验研究可能涉及更明确的和同质的群体。虽然这增加了发现信号的机会，但对这些结果的外部有效性进行了权衡，应该仔细考虑。尽量将重点放在代表预期使用人群的群体上，是将这种风险降到最低的关键。

在某些情况下，例如筛查，目标条件在使用呼吸测试的人群中只是不经常发生。在这些情况下，招募一个丰富的人群往往是进行研究的发现阶段的有效方法。然而，为了获得监管部门批准所需的证据，验证研究总是需要在预定人群中进行。

理想的情况是，在早期测试的发展过程中，研究将集中于 “有意诊断 “的人群。这可以防止开始后续研究时，由于研究之间的人群差异而出现假阴性。